Hadí jed obsahuje enzymy, které hydrolyzují karboxyesterové vazby.Substráty pro hydrolýzu jsou fosfolipidy, acetylcholin a aromatický acetát.Tyto enzymy zahrnují tři druhy: fosfolipázu, acetylcholinesterázu a aromatickou esterázu.Arginin esteráza v hadím jedu dokáže hydrolyzovat i syntetický arginin nebo lysin, ale v přírodě hydrolyzuje především proteinové peptidové vazby, patří tedy k proteáze.Zde diskutované enzymy působí pouze na esterové substráty a nemohou působit na žádnou peptidovou vazbu.Mezi těmito enzymy jsou biologické funkce acetylcholinesterázy a fosfolipázy důležitější a byly plně prostudovány.Některé hadí jedy mají silnou aromatickou esterázovou aktivitu, která může hydrolyzovat p-nitrofenylethylester, a- nebo P-naftalenacetát a ethylester indolu.Dosud není známo, zda je tato aktivita produkována nezávislým enzymem nebo známým vedlejším účinkem karboxylesterázy, natož její biologický význam.Když jed Agkistrodon halys Japonicus reagoval s p-nitrofenylethylesterem a ethylesterem indolu, hydrolyzáty p-nitrofenolu a indolfenolu nebyly nalezeny;Naopak, pokud tyto estery reagují s hadím jedem kobry Zhoushan poddruhu a hadím jedem Bungarus multicinctus, dojde k jejich rychlé hydrolýze.Je známo, že tyto kobří jedy mají silnou cholinesterázovou aktivitu, která může být zodpovědná za hydrolýzu výše uvedených substrátů.Ve skutečnosti Mclean a kol.(1971) uvedl, že mnoho hadích jedů patřících do čeledi Cobra může hydrolyzovat ethylester indolu, ethylester naftalenu a ester butylnaftalenu.Tyto hadí jedy pocházejí z: kobry, kobry černokrké, kobry černé, zlaté kobry, egyptské kobry, královské kobry, zlaté kobry mamby, černé mamby a mamby bílého (D. aw ještě zná chřestýše východního kosočtverce
Hadí jed může hydrolyzovat methylindolethylester, který je substrátem pro stanovení aktivity cholinesterázy v séru, ale tento hadí jed nevykazuje aktivitu cholinesterázy.To ukazuje, že v kobřím jedu je neznámá esteráza, která se liší od cholinesterázy.K pochopení podstaty tohoto enzymu je zapotřebí další separační práce.
1, Fosfolipáza A2
(I) Přehled
Fosfolipáza je enzym, který dokáže hydrolyzovat glycerylfosfát.V přírodě existuje 5 druhů fosfolipázy, jmenovitě fosfolipáza A2 a fosfolipáza
A., fosfolipáza B, fosfolipáza C a fosfolipáza D. Hadí jed obsahuje hlavně fosfolipázu A2 (PLA2), několik hadích jedů obsahuje fosfolipázu B a další fosfolipázy se nacházejí hlavně ve zvířecích tkáních a bakteriích.Obr. 3-11-4 ukazuje místo působení těchto fosfolipáz na hydrolýzu substrátu.
Z fosfolipáz byla více studována PLA2.Může to být nejvíce studovaný enzym v hadím jedu.Jeho substrátem je esterová vazba na druhé pozici Sn-3-glycerofosfátu.Tento enzym se široce vyskytuje v hadím jedu, včelím jedu, jedu štíra a zvířecích tkáních a PLA2 je hojně zastoupen ve čtyřech rodinných hadích jedech.Protože tento enzym štěpí červené krvinky a způsobuje hemolýzu, nazývá se také „hemolyzin“.Někteří lidé také nazývají PLA2 hemolytická lecitináza.
Ludeeke nejprve zjistil, že hadí jed může produkovat hemolytickou sloučeninu působením na lecitin prostřednictvím enzymů.Později Delezenne a kol.dokázal, že když kobří jed působí na koňské sérum nebo žloutek, tvoří hemolytickou látku.Nyní je známo, že PLA2 může přímo působit na fosfolipidy membrány erytrocytů, ničit strukturu membrány erytrocytů a způsobovat přímou hemolýzu;Může také působit na sérum nebo přidaný lecitin za vzniku hemolytického lecitinu, který působí na červené krvinky za vzniku nepřímé hemolýzy.Přestože se PLA2 hojně vyskytuje ve čtyřech rodinách hadích jedů, obsah enzymů v různých hadích jedech je mírně odlišný.Chřestýš (C
Hadí jed vykazoval pouze slabou aktivitu PLA2.Tabulka 3-11-11 ilustruje srovnání aktivity PLA2 10 hlavních jedů jedovatých hadů v Číně.
Tabulka 3-11-11 Srovnání aktivit fosfolipázy VIII u 10 hadích jedů v Číně
Hadí jed
Uvolnění tuku
kyselina alifatická,
Cjumol/mg)
Hemolytická aktivita CHU50/^ g * ml)
Hadí jed
Uvolňovat mastné kyseliny
(^raol/mg)
Hemolytická aktivita “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
jedenáct
Mikracefální ophis
pět bodů jedna nula
kalyspallas
8. 68
dva tisíce osm set
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tři bod osm dva
sto čtyřicet
Bnugarus fasctatus
7,56
dvě stě osmdesát
B. multicinctus
jeden bod devět šest
dvě stě osmdesát
Viper a russelli
sedm bodů nula tři
T, mucrosquamatus
jeden bod osm pět
Siamensis
T. štejnegeri
0,97
(2) Separace a čištění
Obsah PLA2 v hadím jedu je velký a je stabilní vůči teplu, kyselinám, zásadám a denaturačním činidlům, takže se snadno čistí a odděluje PLA2.Běžným způsobem je nejprve provést gelovou filtraci surového jedu, poté provést iontoměničovou chromatografii a další krok lze opakovat.Je třeba poznamenat, že lyofilizace PLA2 po iontoměničové chromatografii by neměla způsobit agregaci, protože proces lyofilizace často zvyšuje iontovou sílu v systému, což je důležitý faktor způsobující agregaci PLA2.Kromě výše uvedených obecných metod byly také přijaty následující metody: ① Wells et al.② Substrátový analog PLA2 byl použit jako ligand pro afinitní chromatografii.Tento ligand se může vázat na PLA2 v hadím jedu s Ca2+.Jako eluent se většinou používá EDTA.Po odstranění Ca2+ se afinita mezi PLA2 a ligandem snižuje a může se oddělit od ligandu.Jiné používají jako eluent 30% organický roztok nebo 6mol/l močoviny.③ Hydrofobní chromatografie byla provedena s PheiiylSephar0SeCL-4B k odstranění stop PLA2 v kardiotoxinu.④ Anti PLA2 protilátka byla použita jako ligand k provedení afinitní chromatografie na PLA2.
Dosud bylo vyčištěno velké množství hadího jedu PLAZ.Tu a kol.(1977) uvedli PLA2 purifikovanou z hadího jedu před rokem 1975. V posledních letech bylo každoročně publikováno velké množství článků o separaci a purifikaci PLA2.Zde se zaměřujeme na separaci a čištění PLA čínskými učenci.
Chen Yuancong a kol.(1981) oddělili od jedu Agkistrodon halys Pallas v Zhejiang tři druhy PLA2, které lze rozdělit na kyselé, neutrální a alkalické PLA2 podle jejich izoelektrických bodů.Podle toxicity je toxičtější neutrální PLA2, který byl identifikován jako presynaptický neurotoxin Agkistrodotoxin.Alkalický PLA2 je méně toxický a kyselý PLA2 nemá téměř žádnou toxicitu.Wu Xiangfu a kol.(1984) porovnávali charakteristiky tří PLA2, včetně molekulové hmotnosti, složení aminokyselin, N-konce, izoelektrického bodu, tepelné stability, enzymové aktivity, toxicity a hemolytické aktivity.Výsledky ukázaly, že mají podobnou molekulovou hmotnost a tepelnou stabilitu, ale mají významné rozdíly v jiných aspektech.Z hlediska enzymové aktivity byla aktivita kyselého enzymu vyšší než aktivita alkalického enzymu;Hemolytický účinek alkalického enzymu na krysí červené krvinky byl nejsilnější, následoval neutrální enzym a kyselý enzym téměř nehemolyzovaný.Proto se spekuluje, že hemolytický účinek PLAZ souvisí s nábojem molekuly PLA2.Zhang Jingkang a kol.(1981) vytvořili krystaly Agkistrodotoxinu.Tu Guangliang a kol.(1983) uvedli, že toxická PLA s izoelektrickým bodem 7,6 byla izolována a purifikována z jedu Vipera rotundus z Fujianu a její fyzikální a chemické vlastnosti, složení aminokyselin a sekvence 22 aminokyselinových zbytků na N - byly stanoveny terminály.Li Yuesheng a kol.(1985) izolovali a čistili další PLA2 z jedu Viper rotundus ve Fujianu.Podjednotka PLA2 * je 13 800, izoelektrický bod je 10,4 a specifická aktivita je 35/xnioI/miri mg。 S lecitinem jako substrátem je optimální pH enzymu 8,0 a optimální teplota je 65 °C LD5 injikovaný intravenózně myším.Je to 0,5 ± 0,12 mg/kg.Tento enzym má zjevné antikoagulační a hemolytické účinky.Toxická molekula PLA2 se skládá ze 123 zbytků 18 druhů aminokyselin.Molekula je bohatá na cystein (14), kyselinu asparagovou (14) a glycin (12), ale obsahuje pouze jeden methionin a jeho N-konec je serinový zbytek.Ve srovnání s PLA2 izolovaným Tuguangem jsou molekulová hmotnost a počet aminokyselinových zbytků těchto dvou izoenzymů velmi podobné a složení aminokyselin je také velmi podobné, ale počet zbytků kyseliny asparagové a prolinu je poněkud odlišný.Hadí jed kobry královské z Guangxi obsahuje bohaté PLA2.Shu Yuyan a kol.(1989) izolovali z jedu PLA2, který má specifickou aktivitu 3,6krát vyšší než původní jed, molekulovou hmotnost 13 000, složení 122 aminokyselinových zbytků, izoelektrický bod 8,9 a dobrou tepelnou stabilitu.Z pozorování účinku bazického PLA2 na červené krvinky elektronovým mikroskopem je vidět, že má zjevný účinek na membránu lidských červených krvinek, ale nemá žádný zjevný účinek na červené krvinky koz.Tato PLA2 má zjevný retardační účinek na elektroforetickou rychlost červených krvinek u lidí, koz, králíků a morčat.Chen a kol.Tento enzym může inhibovat agregaci krevních destiček indukovanou ADP, kolagenem a sodnou solí arachidonové kyseliny.Když je koncentrace PLA2 10/xg/ml~100 ug/ml, agregace krevních destiček je zcela inhibována.Pokud byly jako materiály použity promyté krevní destičky, PLA2 nemohl inhibovat agregaci při koncentraci 20 mg/ml.Aspirin je inhibitor cyklooxygenázy, který může inhibovat účinek PLA2 na krevní destičky.PLA2 může inhibovat agregaci krevních destiček hydrolýzou kyseliny arachidonové za účelem syntézy tromboxanu A2.Konformace roztoku PLA2 produkovaného jedem Agkistrodon halys Pallas v provincii Zhejiang byla studována pomocí cirkulárního dichroismu, fluorescence a UV absorpce.Experimentální výsledky ukázaly, že konformace hlavního řetězce tohoto enzymu byla podobná konformaci stejného druhu enzymu z jiných druhů a rodů, konformace kostry měla dobrou tepelnou odolnost a strukturální změna v kyselém prostředí byla reverzibilní.Kombinace aktivátoru Ca2+ a enzymu neovlivňuje prostředí tryptofanových zbytků, zatímco inhibitor Zn2+ působí naopak.Způsob, jakým hodnota pH roztoku ovlivňuje aktivitu enzymu, se liší od výše uvedených činidel.
V procesu čištění hadího jedu PLA2 je zřejmým jevem, že hadí jed obsahuje dva nebo více elučních vrcholů PLA2.Tento jev lze vysvětlit následovně: ① díky existenci izoenzymů;② Jeden druh PLA2 je polymerizován do různých směsí PLA2 s různými molekulovými hmotnostmi, z nichž většina je v rozmezí 9 000~40 000;③ Kombinace PLA2 a dalších složek hadího jedu komplikuje PLA2;④ Protože je amidová vazba v PLA2 hydrolyzována, mění se náboj.① A ② jsou běžné, až na pár výjimek, jako je PLA2 v CrWa/w hadím jedu
Existují dvě situace: ① a ②.Třetí stav byl nalezen v PLA2 v jedu následujících hadů: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, zmije palestinská, zmije písečná a strašlivý chřestýš km.
Výsledkem případu ④ je změna rychlosti migrace PLA2 během elektroforézy, ale složení aminokyselin se nemění.Peptidy mohou být rozbity hydrolýzou, ale obecně jsou stále spolu vázány disulfidovými vazbami.Jed chřestýše východního obsahuje dvě formy PLA2, nazývané typ a a typ p PLA2.Rozdíl mezi těmito dvěma typy PLA2 je pouze jedna aminokyselina, to znamená, že glutamin v jedné molekule PLA2 je nahrazen kyselinou glutamovou ve druhé molekule PLA2.Ačkoli přesný důvod tohoto rozdílu není jasný, obecně se má za to, že souvisí s deaminací PLA2.Pokud se PLA2 v palestinském jedu zmije udržuje v teple se surovým jedem, koncových skupin v molekulách enzymů bude více než dříve.Z C PLA2 izolovaný z hadího jedu má dva různé N-konce a jeho molekulová hmotnost je 30 000. Tento jev může být způsoben asymetrickým dimerem PLA2, který je podobný symetrickému dimeru tvořenému PLA2 v jedu chřestýše východního. a chřestýš diamantový západní.Asijská kobra se skládá z mnoha poddruhů, z nichž některé nejsou v klasifikaci příliš jednoznačné.Například to, co se dříve nazývalo poddruh kobry z vnějšího kaspického moře, je nyní uznáváno
Mělo by být přičítáno vnější kaspické kobře.Jelikož existuje mnoho poddruhů a jsou smíchány dohromady, složení hadího jedu se díky různým zdrojům velmi liší a vysoký je také obsah izoenzymů PLA2.Například kobří jed
Bylo nalezeno nejméně 9 druhů izozymů PLA2 r^ll druhů a 7 druhů izozymů PLA2 bylo nalezeno v jedu kobry poddruhu Kaspické.Durkin a kol.(1981) studovali obsah PLA2 a počet izoenzymů v různých hadích jedech, včetně 18 kobrích jedů, 3 jedů mamby, 5 jedů zmije, 16 jedů chřestýše a 3 jedů mořských hadů.Obecně je aktivita PLA2 kobřího jedu vysoká, s mnoha izozymy.Aktivita PLA2 a izoenzymy jedu zmije jsou střední.Aktivita PLA2 jedu mamby a jedu chřestýše je velmi nízká nebo žádná aktivita PLA2.PLA2 aktivita jedu mořského hada je také nízká.
V posledních letech nebylo hlášeno, že by PLA2 v hadím jedu existoval ve formě aktivního dimeru, jako je chřestýš východní rhombophora (C. hadí jed obsahuje typ a a typ P PLA2, přičemž oba jsou složeny ze dvou identických podjednotek a pouze dimeráza má
Aktivita.Shen a kol.také navrhli, že aktivní formou enzymu je pouze dimer PLA2 hadího jedu.Studium prostorové struktury také dokazuje, že PLA2 chřestýše diamantového existuje ve formě dimeru.Rybožravá sloučenina
Existují dva různé PLA^ Ei a E2 hadího jedu, ve kterých 仏 existuje ve formě dimeru, dimer je aktivní a jeho disociovaný monomer je neaktivní.Lu Yinghua a kol.(1980) dále studovali fyzikální a chemické vlastnosti a reakční kinetiku E. Jayanthi et al.(1989) izolovali základní PLA2 (VRVPL-V) z jedu zmije.Molekulová hmotnost monomeru PLA2 je 10000, který má letální, antikoagulační a edémové účinky.Enzym může polymerovat polymery s různou molekulovou hmotností za podmínek PH 4,8 a stupeň polymerace a molekulová hmotnost polymerů se zvyšují s rostoucí teplotou.Molekulová hmotnost polymeru generovaného při 96 °C je 53 100 a aktivita PLA2 tohoto polymeru se zvýší o dva
Čas odeslání: 18. listopadu 2022